做自然代妈的口述_跟代母交流该注意什么_ELISA样本制备指南及注意事项

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ELISA样本制备指南及注意事项

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定义及介绍

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。

样本制备指南

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血清

全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品

2.血浆

抗凝剂推荐使用EDTA-Na

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，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。

3组织匀浆/组织全蛋白

用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。

其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。

4.细胞提取液

贴壁细胞

用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；

悬浮细胞

可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10

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个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。

其余方法：

对于

贴壁细胞

：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

对于

悬浮细胞

：离心收集细胞，以2×10

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细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10

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细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

5.细胞培养上清或其他生物体液

收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。

实验细节与注意事项

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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。

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代母出生婴儿办出生证

样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。

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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。

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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。

对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：

稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；

稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；

每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。

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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。

一项将于3月26日在北京执行的医保政策引发关注。

日前，北京市医保局会同市卫生健康委、北京市人力社保局印发了《关于规范调整部分医疗服务价格项目的通知》（以下简称《通知》）。值得关注的是，此次引发的《通知》里将宫腔内人工授精术、胚胎移植术、精子优选处理等16项辅助生殖技术项目纳入医保甲类报销范围。

记者注意到，尽管近几年业内时有关于辅助生殖医疗纳入医保的呼声，但始终未有明确落地举措。此次《通知》发布后，北京即成为国内首个将辅助生殖技术纳入医保范畴的城市。

高额支出成隐形门槛

辅助生殖技术是不孕不育症治疗的重要手段。它通常包括人工授精和体外受精—胚胎移植及其衍生技术两大类。其中最常见的治疗方法就是人工授精和试管婴儿技术。

国家统计局数据显示，我国结婚登记女性的年龄占比中，35岁及以上非最佳育龄妇女的占比正逐年增加。

2021年5月，北京大学第三医院院长乔杰曾参与发布了一项妇幼卫生相关的报告——《柳叶刀中国妇幼健康特邀重大报告》（以下简《报告》）。接受媒体采访时，乔杰指出，中国2015年底放开实施“二孩”政策，但生育意愿未如预期有增长。

她介绍，2007—2020年间，我国不孕发病率已从12%升至18%。这意味着，每6对育龄夫妻中就有一对夫妇面临生育困扰，而这类群体中部分的家庭生育意愿则需要通过辅助生殖技术来实现。

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△ 工作人员准备提取试管婴儿的DNA。

上述《报告》中提及，截至2017年，中国辅助生殖技术总周期数已经超过100万，出生婴儿数超过30万。

然而要通过辅助生殖技术来实现生育并非一件容易的事。“不孕症治疗是个复杂的过程。”北京大学人民医院生殖医学暨计划生育科主任医师鹿群向《中国报道》记者指出，“试管婴儿”单次胚胎移植成功率仅为40%到50%左右，部分患者需二次胚胎移植甚至更多次。

重复取卵，也意味着将有高额的花费产生。一位生殖医学相关的从业者告诉记者，正常情况下，包括辅助生殖技术治疗之前的全身检查、促排卵、胚胎培养及移植等项目，一次成功地孕育一个“试管婴儿”的价格为3万元左右。难以确保的成功率和居高不下的治疗费用成了人工辅助生殖的隐形门槛。

鹿群向记者介绍，北京市此次共规范调整了公立医疗机构开展的63项医疗服务价格项目规范调整，其中对体外受精胚胎培养等53项辅助生殖技术项目进行统一定价，基本涵盖北京市公立医疗机构常用的辅助生殖的技术项目。

她表示，纳入医保的16项中有2项是宫腔人工授精的项目，1项是二代试管婴儿（卵细胞浆内单精子注射）的项目，3项是三代试管婴儿（植入前胚胎遗传学检测）的项目，其余则为体外受精-胚胎等项目。按照鹿群的估算，在这项政策正式实施后，大约能通过医保为不孕不育症患者节省四分之一至三分之一的治疗费用。

医保能否负担

《中国报道》记者梳理发现，辅助生殖技术纳入医保的呼声从2014年就有提及，但这一呼吁直至2021年才有“回音”：2021年9月，国家医保局在答复十三届全国人大四次会议第5581号建议“不孕不育症辅助治疗纳入国家医保提高人口增长的建议”时明确表示，诊疗方面，在科学测算，充分论证的基础上，逐步把医保能承担的技术成熟、安全可靠、费用可控的治疗性辅助生殖技术按程序纳入医保支付范围。

这期间“二孩”“三孩”政策相继出台，但出生率仍在持续走低。国家统计局的数据显示，2021年人口出生率为7.52‰，创下近年来新低。

鹿群告诉《中国报道》记者，现阶段把辅助生殖技术项目纳入医保是扭转生育率走低趋势的积极举措之一。在她看来，纳入医保是一个循序渐进的过程，从完全自费到纳入医保报销，这体现了国家对生育支持的大力投入。医保的介入能在一定程度上减轻患者的支出压力，能让更多的不孕夫妇积极尝试人工辅助生殖技术

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△ 医生将精子滴入装有卵子的培养皿中后用显微镜监测。

记者查询发现，上海、浙江等地都曾有过提供辅助生殖经济支持的探索，但始终未将这一“非基本医疗”纳入医保的动作。

北京大学社会学系教授陆杰华告诉《中国报道》记者，北京率先将辅助生殖医疗的部分项目纳入医保不仅是个良性的探索，同时也释放了一个积极的信号，即经济相对较发达的地区，在保护育龄妇女生育权益上应当走在前列。

至于能对北京本地生育率带来多大程度的改善，陆杰华和鹿群均认为需要结合这项政策实施之后落地的情况进行精准评估。

虽然这一政策利好生育，但社会比较关注“医保能否负担得起这笔开支”。

记者注意到，《通知》中公布的16项辅助生殖技术价格区间在100元—5200元不等。其中3项价格较高的三代试管婴儿技术胚胎单基因病诊断、染色体疾病的植入前胚胎遗传学检测、囊胚/卵裂球/极体活检术也列入其中，三者合计10360元。甲类报销比例若按70%计算，则医保将为这三项担负7252元。

根据国家统计年鉴，北京2020年医保基金累计结余1353.7亿元。这一数字在业内看来算得上“医保资金池较为宽裕”。上述不愿具名的生殖医学从业者告诉记者，从目前北京的医保结余来看，担负这比开支“难度不大”。

有望全国推广

记者注意到，近年来国家层面陆续为提高生育率推出了育儿假、产假、生育奖励等多项积极的举措，推动作用尚不显著。

据2017年生育状况抽样调查数据显示，2006至2016年我国育龄女性平均初育年龄从2006年的24.3岁上升到 2016年的26.9岁。乔杰表示，年轻夫妇育龄意愿的下降也导致了高龄妊娠、不孕、流产、出生缺陷和其他不良妊娠风险的增加。

△ 护士准备为患者注射促超速排卵药物。

陆杰华告诉《中国报道》记者，要解决眼下育龄夫妇不愿生、不敢生的问题，首先要究其真正的痛点，如生育文化、生育成本等，要综合考虑，标本兼治。

在他看来，将辅助生殖医疗纳入医保就是在成本问题上推出的积极举措。陆杰华表示，北京的积极探索是个信号，之后或许会有更多的地区对此响应。

记者注意到，此前河南省医疗保障局就曾对网友提出的“将辅助生殖医疗项目纳入医保问题”给出回应称：“在当前情况下，基本医疗保险制度主要还是立足于为群众提供基本医疗保障，着力满足基本医疗需求，还没有能力将支付范围扩大到辅助生殖类项目。”

“各地的财政情况不一，相关的措施细节也可能会有差异，因地制宜。”陆杰华说。

在长期与患者打交道的鹿群看来，若要在全国铺开，则需要因地制宜，根据不同地方患者对辅助生殖技术需求的不同，制定更有针对性、更能凸显支持力度的医保政策。另外，“对于不同的地方而言，跨省就医的不孕症患者如何解决医保问题仍有待讨论。”鹿群提到，由于不同的地区辅助生殖医疗发展水平不平衡，跨地区就医现象仍将长期存在，这些都应被纳入统筹考量的范畴。

撰文：《中

国报道》记者 邱慧

图片来源：新华网、中新网

责编：徐豪

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